靈芝孢子粉對人肝癌細胞HepG2及裸鼠移植瘤生長的抑製作用

背景资料 灵芝是担子菌纲多孔科灵芝属真菌, 公认为扶正固本, 滋补强壮的传统中药. 临床报道孢子粉可改善机体的免疫功能, 防治癌症, 减轻患者对放、化疗的不良反应. ■同行评议者 张吉翔, 教授, 南昌大学第二附属医院消化内科 王顺官, 等. 灵芝孢子粉对人肝癌细胞HepG2及裸鼠移植瘤生长的抑制作用 1115 www.wjgnet.com 制肿瘤细胞生长的作用. 关键词: 灵芝孢子粉; HepG2; 肝癌; 四唑盐比色法 王顺官, 王筱婧, 李琳, 徐江平. 灵芝孢子粉对人肝癌细胞HepG2及裸鼠移植瘤生长的抑制作用. 世界华人消化杂志 2008; 16(10): 1114-1118 0 引言 灵芝是担子菌纲多孔科灵芝属真菌, 其生长成熟后所散发出来的孢子体即灵芝孢子粉. 灵芝孢子粉富含多糖肽, 有机锗, 多种氨基酸, 脂肪酸及微量元素等成份. 临床报道孢子粉可改善机体的免疫功能, 防治癌症, 减轻患者对放、化疗的不良反应. 以往药理研究表明, 灵芝孢子粉可增强免疫功能, 并对多种移植性动物肿瘤有明显的抑制作用 [1-3] . 但灵芝孢子粉对体外培养 人癌细胞的直接作用及人癌裸鼠移植瘤治疗作用的研究则较少. 本文报道灵芝孢子粉体外对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用及对裸小鼠人HepG2移植瘤的抗肿瘤作用的研究.1 材料和方法 1.1 材料 HepG2为人肝癌细胞株, 武汉大学中国典型培养物保藏中心, 用DMEM培养基(含100 mL/L小牛血清, 青霉素100 kU/L, 链霉素100 mg/L), 37℃, 50 mL/L CO2培养. 实验动物为6-9 wk龄BALB/c裸小鼠, 22-30 g, 23只, 雌雄兼有, 无特定病原体(SPF)条件下饲养, 由南方医科大学动物实验中心提供. 灵芝孢子粉(B), 广州盈康科技有限公司提供. 5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil, 5-FU), 江苏南通精华制药有限公司产品. 噻唑蓝(MTT), Sigma产品, 北京鼎国公司分装, 用PBS配制成5 g/L溶液, 无菌滤膜过滤, 4℃避光保存. 1.2 方法 1.2.1 体外细胞毒实验(MTT法): 按照Mosmann et al[4] 描述的方法进行实验. 取对数生长期的HepG2细胞, 2.5 g/L胰酶消化成单个细胞, 配制细胞悬液, 计数板计数为5×107 cell/L, 于96孔培养板内每孔接种100 µL(每孔含5×103 个细胞, 经反复实验得出较为合适的细胞数目), 放入培养箱中孵育, 24 h贴壁弃上清液, 加入180 µL DMEM培养基继续孵育24 h使细胞生长同步化. 用加入终浓度为10 g/L DMSO的DMEM配制灵芝孢子粉B, 设5个浓度, 5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L、0.625 g/L、0.3125 g/L, 并用0.22 µm微孔 滤膜过滤除菌. 阳性对照5-FU DMEM稀释, 使终浓度为180 mg/L(通过从250 mg/L、180 mg/L、150 mg/L、120 mg/L、90 mg/L、60 mg/L等6个浓度中筛选出较合适浓度). 并设调零孔, 空白对照及等体积DMSO溶剂对照, 每组设5-6个平行孔. 待HepG2细胞同步化完成后, 加入药物20 µL/孔, 空白孔加入等量DMEM. 放入孵箱中分别孵育24 h、48 h、72 h、96 h后, 每孔加入MTT 20 µL, 放入孵箱继续孵育4-6 h. 终止培养, 小心吸弃孔内培养液上清, 每孔加入DMSO 150 µL, 振摇15 min, 使甲臢结晶充分溶解. 于酶标仪570 nm处测各孔A值, 并计算药物对细胞生长的抑制率, 抑制率 = (1-给药组平均A值/对照组平均A值)×100%. 以上每组实验重复3次, 并用Logit法计算半数抑制浓度IC50值. 1.2.2 体内抑瘤实验(人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的生长抑制实验): 取对数生长期的人肝癌HepG2细胞, 2.5 g/L胰酶消化后, 用无血清DMEM配成1×1010 cell/L的单细胞悬液. 在无菌条件下接种于裸鼠腋窝皮下, 0.2 mL/只(相当于每只裸鼠接种2×106个肿瘤细胞)[5]. 接种1 wk后可见肿瘤生长, 当肿瘤大小到直径约为3-4 mm时(接种10 d以后), 将荷瘤裸鼠按肿瘤大小随机分为3组, 每组7-8只裸鼠, 雌雄兼有, (1)空白组: 生理盐水100 mL/kg, ig, 每日给药; (2)阳性对照组: 5-FU, 用生理盐水稀释, 无菌分装, 20 mg/kg, ip, 隔日给药; (3)给药组: 灵芝孢子粉B, 5 g/L CMC-Na配制, 高压灭菌, 2000 mg/kg, ig, 每日给药. 共给药21 d. 自接种后每日测量裸鼠体质量, 每周用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长(a)短(b)径, 并按以下公式计算相对体积. V = 0.5ab2, 各组按时间点的平均瘤体积作生长曲线图. 末次给药后24 h时处死动物, 剥离肿瘤称质量. 做大体和病理观察, 部分肿瘤组织用40 g/L多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 连续4 µm切片, HE染色, 光镜下观察肝癌细胞坏死, 形态改变情况. 计算各组抑瘤率, 抑瘤率 = (1-用药组平均瘤质量/空白组平均瘤质量)×100%, 实验重复两次. 统计学处理 用SPSS10.0统计软件进行分析, 结果以mean±SD表示, 用One-Way ANOVA和t-test进行分析. 给药组组间比较用LSD法.2 结果 2.1 灵芝孢子粉水溶性成份对HepG2细胞的作用 灵芝孢子粉水溶性成份对HepG2细胞具有明显的抑制作用, 随着时间延长和剂量的增加, 对 ■研发前沿 药理研究表明, 灵 芝孢子粉可增强免疫功能, 并对多种移植性动物肿瘤有明显的抑制作用 . 1116 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 ２００８年４月８日 第１６卷 第１０期 肿瘤细胞的抑制作用越强, 具有一定的时间和剂量效应关系. B药对HepG2细胞的IC50值, 随着作用时间增加而减小, 在72 h时达到最低, B药的IC50值为2.14 g/L, 表明HepG2细胞在72 h时对B药最为敏感(表1). 空白组和B组作用72 h后镜下观察结果, 可看出灵芝孢子粉对HepG2细胞具有明显的抑制作用(图1A-B). 2.2 体内抑瘤实验 高剂量的灵芝孢子粉B对裸小鼠移植瘤的生长具有一定抑制作用, 并且对裸鼠体质量增加无影响(表2). 观察其活动进食状况均无明显异常, 表明灵芝孢子粉B对裸鼠的生长并无明显的毒副作用. 当ig给药剂量为2000 mg/kg时, 其对裸鼠移植瘤生长的抑制率达到了57.0%(图2, 表3). 2.3 病理观察-大体观 对照组肿瘤组织大, 血供丰富, 质脆, 易出血, 界限不清, 不易分离, 切面呈鱼肉样, 灵芝孢子粉治疗组肿瘤组织小, 血供不丰富, 界限较为清楚. HE染色镜下观察: 对照组表现为肿瘤组织内见小片坏死, 肿瘤细胞生长旺盛, 呈条状、索状, 细胞核异型性明显, 细胞分化较低, 间质血管丰富(图3A). 灵芝孢子粉治疗组表现为肿瘤组织内坏死区增大, 肝癌细胞部分呈梭型, 间质血管较稀少, 有明显的纤维化形成, 可见肿瘤细胞生长受到抑制(图3B). ３ 讨论 灵芝被公认为扶正固本, 滋补强壮的传统中药